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免疫组织化学染色方法(间接法)

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:32531次

一、ABC 法(SP、LSAB、SABC法步骤相同)

    ABC(avidin-biotin comeplex)卵白素-生物素复合物法属于亲和免疫组织化学技术,根据卵白素-生物素高亲和力的生物学特性,用生物素与过氧化物酶结合获得生物素过氧化物酶,再加入卵白素和生物素形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。而LSAB、S-P、SABC是以抗生物素蛋白链酶素代替卵白素,用标记了过氧化物酶的抗生物素蛋白链酶素(SA)代替ABC复合物,步骤相同,但由于SA分子量较小,穿透性较好,反应速度较快。并且SA有两个和生物素亲和力极高的结合点,其本身没有连接生物素,可以与二抗上的生物素连结,比ABC更容易与二抗上的生物素结合,故敏感性高,复合物也不需要使用前混合,更为简单方便。ABC为三步法,第二抗体为生物素化的IgG(或IgM、IgA等),其中的Fab片段与第一抗体结合,这就要求与第一抗体相配对,如第一抗体是鼠抗,第二抗体应该为抗鼠的(或IgM、IgA等);如第二抗体是兔抗,第二抗体应该为抗兔的(或IgM、IgA等),还有羊、大鼠、马等来源的抗体。如果使用了鼠兔通用型二抗,那当一抗是鼠或兔时就不必再分了。由于卵白素和生物素亲和力强,故ABC较PAP敏感20-40倍。最后通过复合物上的过氧化物酶与显色反应形成有颜色的沉淀物,可用显微镜观察。过氧化物酶最好的显色剂为DAB,形成不溶于水的棕色颗粒,可用酒精脱水、二甲苯透明;如用AEC显色,生成溶于水的红色沉淀,故不能脱水,只能用水溶性封片剂封固,不利于长期保存。

步骤:
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。水洗。
3、抗原修复:(1)pH7.2 TBS 缓冲液洗三次,胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。或(2)按说明书要求:蒸馏水洗,放入抗原修复液(Ph6.0)内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或(3) 按说明书要求:不处理)
4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃,30分钟。
6、甩去多余血清,加一抗37 ℃,30分钟。,
7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
8、滴加二抗,37 ℃,30分钟。
9、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
10、滴加ABC复合物,37 ℃,45分钟。
11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
12、DAB显色3~10分钟。
13、水洗。
14、苏木素淡染,蓝化,脱水,透明,封固。

二、PAP法

步骤:
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。水洗。
3、抗原修复:(1)pH7.2 TBS 缓冲液洗三次,胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。或(2)按说明书要求:蒸馏水洗,放入抗原修复液(Ph6.0)内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或(3) 按说明书要求:不处理)
4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃,30分钟。
6、甩去多余血清,滴加特异性抗体37℃30—60分钟或4℃过夜,置湿盒中。
7、PBS洗。
8、滴加二抗,37 ℃,30分钟。
9、 pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
10、加PAP抗体37℃ 30分钟。
11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次,DAB显色3~10分钟。
12、水洗。
13、苏木素淡染,蓝化,脱水,透明,封固。

     三、APAAP法

    APAAP:属于非标记抗体法,通过具有高特异性的抗碱性磷酸酶抗体,并在抗酶抗体中加入大量的碱性磷酸酶,使碱性磷酸酶充分结合在抗酶抗体上,形成可溶性的APAAP复合物,常用的显色剂为BCIP/NBT、固红或固蓝。特点不会与内源性过氧化物酶反应,所以背景较为干净,特别适合内源性过氧化物酶较多的组织,如肝、肾。

步骤:
1、切片脱蜡至水(冰冻切片或细胞涂片用PBS浸泡3分钟,不需抗原修复)
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室
   温20分钟。水洗。
3、抗原修复:(1)pH7.2 TBS 缓冲液洗三次,胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。或(2)按说明书要求:蒸馏水洗,放入抗原修复液(Ph6.0)内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或(3) 按说明书要求:不处理)
4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃,30分钟。
6、甩去多余血清,适当稀释的特异性抗体,37℃ 60分钟,或4℃过夜。
7、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。
8、桥抗体,37℃ 40分钟或室温1小时。
 9、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。
10、滴加适当稀释的APAAP复合物,37℃30分钟。
  11、TBS或PBS(pH7.2)洗3次。
  12、滴加AKP底物溶液,37℃ 15——30分钟,阳性结果显现清晰后流水冲洗。
  13、复染(核固红或苏木素或甲基绿)1—2分钟,常规冲洗后,甘油明胶封片。

四、 LDP(labelled dextran polymer)法(Envision 二步法)

    酶标聚合物法,应用了酶标聚合物技术,如EnVison检测系统,采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在葡萄糖聚合物上,再与二抗连接,形成EnVison二抗;象PowerVision检测系统,采用了辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记在氨基酸片段上。由于聚合物上超过20个以上的位点能与一抗结合,聚合物上的酶数量也较多,故较ABC、LSAB等方法更为敏感。最为重要的是,由于LDP系统二抗上没有生物素的存在,不会出现ABC、S-P等方法中出现的与内源性生物素结合的交叉反应,减少了非特异性着色,背景更为干净。

步骤:
1、切片脱蜡至水
2、0.3%H2O2甲醇液:阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室温20分钟。自来水洗。
3、抗原修复:(1)pH7.2 TBS缓冲液洗三次,胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。或(2)按说明书要求:蒸馏水洗,放入抗原修复液(Ph6.0)内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或(3) 按说明书要求:不处理)
4、pH7.2 PBS缓冲液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃,20分钟。
6、甩去多余血清,加一抗,37 ℃,30分钟。
7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
8、滴加Envision二抗,37 ℃,30分钟。
9、pH7.2 TBS 缓冲液洗三次。
10、DAB显色3~10分钟。
11、水洗。
12、苏木素淡染,蓝化,脱水,透明,封固。

              
五、双重染色法
1、切片脱蜡至水
2、阻断内源性过氧化物酶(198毫升甲醇或水+2毫升30% H2O2)室温
20分钟。 水洗。
3、抗原修复:(1)pH7.2 TBS缓冲液洗三次,胰蛋白酶消化37 ℃,30分钟。或(2)按说明书要求:蒸馏水洗,放入抗原修复液(Ph6.0)内微波修复20分钟、或电炉加热30分钟、或高压锅加帽出气后3分钟,快速冷却;或(3) 按说明书要求:不处理)
4、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
5、滴加正常血清37 ℃,30分钟。(可不用)
6、甩去多余血清,加一抗37 ℃,30分钟。
7、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
8、滴加生物素化二抗,37 ℃,30分钟。
9、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
10、滴加ABC或S-P复合物(辣根过氧化物酶),37 ℃,45分钟。
11、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
12、DAB(棕色)或AEC(红色)显色3~10分钟。
13、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
14、滴加正常血清37 ℃,30分钟。(可不用)
15、甩去多余血清,加第二种一抗37 ℃,30分钟。
16、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
17、滴加生物素化二抗,37 ℃,30分钟。
18、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。  
19、滴加碱性磷酸酶复合物,37 ℃,30分钟。
20、pH7.2 TBS缓冲液洗三次。
21、BCIP/NBT显色(蓝色)
22、水洗
23、甲基绿复染,脱水,透明,封固。
   如果选择辣根过氧化物酶可选择DAB(棕色)显色,在第21步用辣根过氧化物酶复合物,第23步用AEC(红色)显色,但要注意的是AEC不能长期保存。如选择另一个为碱性磷酸酶可选用BCI/NBT、AP-Red、AP-Orange,用BCI/NBT显色最好。

六、免疫金法(IGS)
 (1)切片常规脱蜡入水。
(2)用0.1%胰蛋白酶液消化,37℃ 10-30分钟。
(3)双蒸水洗2次。
(4)0.05 mol/L TBS PH7.4 洗10分钟。
(5)1%卵蛋白封闭10分钟。
(6)滴加特异性一抗,室温2小时或4℃过夜。
(7)0.5 mol/L TBS PH7.4洗3次。
(8)1% 卵蛋白封闭10分钟。
(9)稀释金标抗体37℃ 45分钟。。
(9)0.05 mol/L TBS PH7.4洗3次。
(10)双蒸水洗2次。
(11)1%戌二醛10分钟。
(12)双蒸水洗3次。
(13)复染、甘油封片、观察。
   结果:胶体金结合部位呈红色。
  
七、免疫金银法(IGSS)
(1)切片常规脱蜡入水。
(2)经含汞固定液固定的组织切片需经0.5%碘酒精脱汞,然后入0.5%硫代硫酸纳水溶液脱碘,流水冲洗,双蒸水洗干净, 0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。
(3)用0.1%胰蛋白酶液消化,37℃ 10-30分钟。
(4)0.05 mol/L TBS PH7.4液洗。
(5)1% 卵蛋白封闭10分钟。
(6)滴加适当稀释的特异性抗体37℃ 1-2小时或4℃过夜。
(7)0.05mol/L TBS PH7.4 液洗3次。
(8)1% 卵蛋白封闭10分钟。
(9)滴加适当稀释的金标记抗体室温下37℃45分钟。
(10)0.05 mol/L TBS PH7.2 液洗3次。
(11)蒸馏水洗2次,双蒸水洗2次。
(12)入银显影液中3—5分钟,反应过程需避光。
(13)蒸馏水洗。
(14)自来水冲洗,苏木素淡复染。
(15)脱水、透明、封片、观察。
结果:特异性抗体结合部位呈灰黑色颗粒,背景呈清灰色,核呈淡蓝色。
试剂配制:
银显影液:
1、硝酸银显影液:
(1)10%阿拉伯胶水溶液60ml,柠檬酸缓冲液pH3.510ml
(2)对苯二酚1.7g加双蒸水30ml。
(3)硝酸银40mg加双蒸水2ml。
(1)和(2)两液完全溶解混合,临用前加(3),暗处显影。
2、0.05 mol/L TBS (pH7.4):
 Tris  12.1g,
 NaCl  17.5g,

双蒸水1900ml,充分搅拌溶解,用浓HCl调pH为7.4,再加双蒸水至2000ml




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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