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原位分子杂交技术

时间:2007-12-23  作者:丁伟  阅读:22559次

原位杂交技术的基本方法包括:
①杂交前准备:包括固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;
②杂交;
③杂交后处理;
④显示:包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。
一、固定
原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构,最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平;使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的,mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。为了减少RNA被酶降解,取材后应尽快冷冻或固定。
1、最常用多聚甲醛固定组织,因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会影响探针穿透入细胞或组织。
2、醋酸-酒精的混合液和Bouin固定剂也能获得较满意的效果。
3、mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1-2h,在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中,置4℃冰箱过液,次日切片或保存在液氮中。
4、组织也可在取材后直接置入液氮冷冻,切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10min,空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定,在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋,这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号,但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加,影响核酸探针的穿透,因而杂交信号常低于冰冻切片。同时,在包埋的过程中可减低mRNA的含量。
二、玻片和组织切片的处理
1、玻片的处理
玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗,自来水清洗干净后,置于清洁液浸泡24h,清水洗净烘干,95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150℃或以上过液以去除任何RNA酶。盖玻片最好用硅化处理,锡箔包裹无尘存放。
载玻片最好用硅化玻片,也用多聚赖氨酸液或APES胶处理。
2、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
增强组织通透性常用的方法如应用稀释的Triton X100(又称去垢剂或清洗剂),用消化酶如蛋白酶K,胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶、淀粉酶等处理。
3、减低背景染色
背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后的酶处理和杂交后用去垢剂洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后,浸入乙酰酐和三乙醇胺中以减低静电效应,减少探针对组织的非异性背景染色。
预杂交也是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特性杂交点的目的,从而减低背景染色。
在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20μg/ml)洗涤一次,减少残留的内源性的RNA,降低背景染色。
4、防止RNA酶的污染
由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶,为防止其污染影响实验的结果,在整体杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240℃)烘烤以消除RNA酶。
三、杂交
杂交是将杂交液滴于切片组织上,加盖硅化的盖玻片,防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。(硅化的盖玻片的优点是不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触)。
四、杂交后处理
杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度盐溶液的漂洗。
杂交后,用RNA酶液来洗涤,能将组织切片中非碱基配对RNA除去。遵循的原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高,在漂洗的过程中,切片不能干燥。干燥的切片使大量的非特异性结合无法洗去。
五、检测系统
根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。
六、对照实验和结果的判断
对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定,常用的对照试验有下列几种。
1、将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。
2、将非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。
3、将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。应用同义RNA(sense probe)进行杂交。
4、以下不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。
5、组织对照已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。
6、应用未标记探针做杂交进行对照。




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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