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电镜酶细胞化学技术简介

时间:2007-12-23  作者:fzxd888  阅读:13642次

  酶存在的特定位置称为酶的定位。酶的细胞化学技术就是通过酶的特异性细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位,对于酶的细胞化学来说,酶的特异性是很重要的。
    电镜酶细胞化学技术是在光镜细胞化学的基础上发展起来的新的一门技术,到目前为止,能在电镜下定位的酶有100多种,主要通过酶的活性作用结果间接地证明酶的存在。一般先将酶原位固定在细胞内,再使它与特定的底物起反应,底物的分解物经过捕捉反应沉着于发生分解的原位上,最后使沉着物变为在电镜下可以看到的物质。在整个处理过程中必须保存酶的活性不受破坏。目前能在电镜下定位的酶有三大类即水解酶、氧化酶和转移酶。
一、酶细胞化学反应的基本原理
(一)水解酶
    水解酶可分为五类即磷酸酶类、酯酶类、芳香基硫酸酯酶类、糖苷酶类以及作用于肽腱酶类。水解酶是催化水解反应的酶类,在超微结构水平上显示酶的细胞化学方法都是以孵育阶段为中心,孵育液中一般都有酶的反应底物和捕捉剂。反应的基本原理可分两个步骤:1、底物经过酶的分解形成初级反应产物;2、初级反应产物和相应的捕捉剂形成一种不溶性的化合物称为最终反应产物,这些最终反应产物是一些不溶性重金属沉淀物(如铅、铜、钡等),在电镜下容易被检出。一般来说,这些沉淀物在细胞的位置就代表了酶促反应的位置。
(二)氧化还原酶
   氧化还原酶可分为氧化酶和脱氢酶两种。
   在氧化酶细胞化学反应中含有两个既分开又紧密联系的底物,一个是生理底物如氧或过氧化氢;另一个是捕捉底物,通常是四盐酸3,3‘二氨基联苯胺(DAB)。DAB很容易氧化,经过一系列化学变化生成强嗜锇性的聚合物,再经锇酸固定就形成锇黑。
脱氢酶常用的捕捉剂为铁氰化物,它在酶的作用下被还原为亚铁氰化物,在铜离子的存在下进一步形成高度不溶性的亚铁氰化铜沉淀。
(三)酶细胞化学的常规操作流程:
1、固定:常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液,根据不同酶的特性,也可以单独使用其中一种作为固定液。一般固定液需要用缓冲液配置,具体使用何种缓冲液要看具体酶的性质而定。常用的缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液以及二甲砷酸钠缓冲液等。
2、切片:一般采用组织切片机进行切片,厚度在40~60µm,也可以用冰冻切片机切片。
3、漂洗:用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次,每次10分钟。
4、孵育:孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内,在震荡式恒温水浴箱中孵育,孵育温度一般为37℃。如果没有震荡式恒温水浴箱,在孵育过程中,每5分钟摇晃一次,使孵育液渗透均匀。孵育时间因器官和酶的种类不同而有很大差异(具体时间见各种酶的孵育液的配方及孵育方法)。
5、漂洗:用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次,每次10分钟,然后用0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次,每次10分钟,所用缓冲液要保持在4℃左右。
6、后固定:用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。
7、脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。
8、电镜观察:超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好,可以进行铅—铀双重染色,但必须有不染色的切片对照。
(本文由版主: fzxd888发表)




参考文献:
1、王伯沄,李玉松,黄高升,张远强《病理学技术》
2、凌启波《实用病理特殊染色和组化技》
3、刘介眉等《病理组织染色的理论方法和应用》
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